發(fā)生污染，既耽誤時間又是一個災難，熟練的無菌操作能避免許多問題，但早期檢測污染是一種可以預警的方法。對于培養(yǎng)箱中的每瓶細胞都要注意觀察，要養(yǎng)成習慣，每次打開培養(yǎng)箱時，迅速看看有沒有發(fā)生污染。

細菌、酵母、真菌、霉菌、支原體以及其他的培養(yǎng)細胞都可能引起污染。

怎樣識別污染

一、肉眼觀察，把培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿拿起來，對著光線檢查。

• 渾濁情況。即使細胞密度很高，培養(yǎng)基也應該是透明的。輕輕移動或晃動培養(yǎng)瓶，觀察培養(yǎng)基的渾濁或懸浮情況，一些霉菌可能會在培養(yǎng)基的表面形成菌落。

• 培養(yǎng)基顏色的變化。酸性條件下，加了酚紅的培養(yǎng)基會由紅變黃，而堿性條件下會變成紅紫色。細菌污染常常會使培養(yǎng)基變成黃色，真菌污染會使培養(yǎng)基變成深紫紅色。

• 聞！當然不能打開瓶子去聞，把鼻子貼在瓶口聞，許多污染發(fā)生以后都會散發(fā)出易察覺的、特殊的氣味，甚至一打開培養(yǎng)箱門就聞到了。

二、顯微觀察。在倒置顯微鏡下，先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物鏡（總放大倍數(shù)為400) 觀察細胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中的細胞：

• 其他有機體。在低倍鏡下，真菌的菌絲體成長棒狀，并橫穿整個視野，還可以觀察到酵母，有時呈小圓球形，有時還有芽。

在高倍鏡下可以觀察到細菌，它們可能是棒狀或球狀，單獨成鏈或成團存在，它們也可能和細胞混在一起，并且明顯處于細胞內(nèi)部，有些細胞可能已經(jīng)裂解變得模糊。觀察時可能每兩個視野才出現(xiàn)一個污染（當然也算被污染了?。?，而且可能污染物是可以運動的。

• 損傷細胞。感染會殺死細胞，可能導致每個細胞都裂解和／或細胞層從附著物上*剝離，更可能的是細胞變得不規(guī)則（或大或小），在低倍鏡下是黑色的粒狀

懸浮培養(yǎng)細胞比貼壁培養(yǎng)細胞更加難以顯微觀察，尤其是高倍顯微鏡下。

• 將培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿放在顯微鏡的載物臺上，靜置一會。

• 將焦距對準器皿的底部，觀察那些輕微附著的細胞，因為它們可能已經(jīng)接觸到了微生物。

• 對準整個培養(yǎng)瓶焦距，當發(fā)現(xiàn)細胞的時候，用細聚焦調節(jié)旋鈕調節(jié)，仔細檢查周圍的培養(yǎng)基有沒有污染發(fā)生。

如果你不能確定是否發(fā)生了污染

• 制作濕涂片或染色片。取1 ml 培養(yǎng)基離心，用50 μl 培養(yǎng)基或緩沖液重新懸浮細胞，滴一滴到載玻片，蓋上蓋玻片制成濕涂片；或涂片、固定并染色（甲基蘭或革蘭氏染液），在高倍鏡下觀察。

• 將細胞在營養(yǎng)培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基上劃線， 37℃培養(yǎng)3 天。如果有菌落，那么細胞被污染了。

• 取1 ml 的細胞培養(yǎng)液至無菌的微量離心管中， 37℃培養(yǎng)3 天。觀察到渾濁物，做濕涂片顯微鏡觀察。

Mynox®殺除支原體功能強大有效，但價格較貴。

方法三：對于已耗費很多時間，大量擴增起來的細胞，或經(jīng)過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞，如果發(fā)現(xiàn)細胞被支原體污染了，怎么辦？此時由于前期工作量巨大，使操作人員無法丟棄已有細胞。

但由于價格原因，又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體，

同時，實驗人員還需要清除細胞上的支原體污染，讓實驗得以往下推進，以最終獲得準確的實驗數(shù)據(jù)。

此時，實驗者可選用對支原體有效的抑制劑，通過對細胞的前期處理，中期加藥，逐步通過4代左右的培養(yǎng)，得以將支原體污染*清除，確保試驗順利推進，結果準確。

此類試劑眾多，筆者周圍的實驗人做過很多嘗試，其中效果最確切且性價比較高的當屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是：通過抑制支原體增殖中DNA和蛋白的合成，達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield®時，不需使用鏈青霉素。

 

操作步驟：

第一步：研究發(fā)現(xiàn)，98%的支原體污染發(fā)生在細胞間隙。因此，首先要把細胞消化下來，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復三次。此時可將細胞上大部分的支原體去除，為進一步加藥抑制做好準備。

第二步：培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield®，細胞進行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著細胞的換液逐步減少，通過4代左右的培養(yǎng)，細胞中的支原體基本可被*清除。