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支原體污染的影響是什么?如何應(yīng)對呢?

更新時間:2021-01-06  |  點擊率:936

細胞培養(yǎng)過程中,由于實驗環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此,細胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。據(jù)美國數(shù)據(jù)統(tǒng)計,細胞發(fā)生支原體污染的幾率在70%以上。

同時,由于支原體直徑很小,僅在180nm~350nm之間,只有通過電鏡才能看到。因此,支原體污染不易被實驗者肉眼發(fā)覺。而支原體污染是個循序的過程,普通抗生素對其無效。因此,被支原體污染的細胞會持續(xù)受到影響,導(dǎo)致實驗數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

支原體污染不僅是細胞培養(yǎng)中需要克服的現(xiàn)象,而且是制藥、生物制品生產(chǎn)中需要加以避免的。支原體污染的影響是什么?

 

 

抑制細胞增殖達50%

●影響免疫反應(yīng)

●影響病毒增殖和感染率

●引起染色體畸變和易位

●干擾雜交瘤技術(shù)使被污染細胞在HAT培養(yǎng)基更敏感

●在細胞壁上附著支原體會改變細胞壁完整性。

●降低電穿孔轉(zhuǎn)染率達5%

總之,支原體污染影響細胞所有的代謝功能。

 

細胞被支原體污染,解決方案

方法一:確認細胞已被支原體污染,終止試驗,丟棄所有被污染的細胞和耗材。

重新復(fù)蘇細胞,注意選用未被污染的細胞株、血清和培養(yǎng)基,并規(guī)范操作。

方法二:對于珍貴的,樣品不可再得的細胞,或價格昂貴的種子細胞,不但無法丟棄,而且作為種子細胞,還需要**支原體污染。

此時,需選用特異性的支原體殺除劑,清除污染,保護細胞。

目前世界上有效的方法是是德國的一款生物試劑,由Minerva公司生產(chǎn),品名Mynox®。

此試劑可在2-3小時內(nèi)將支原體主動殺除,但對細胞無毒害作用。特別適合細胞保種。

Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑,加入培養(yǎng)液中,可特異性地與支原體膜結(jié)合,改變膜通透性。通過此生物物理的方法,2~3小時內(nèi),即可把細胞中的支原體殺除掉。因為細胞膜結(jié)構(gòu)與支原體膜不同,故Mynox®不會與細胞膜結(jié)合,因此無細胞毒性。

注意:3小時后,需將此試劑洗脫,將細胞更換到新的培養(yǎng)耗材和培養(yǎng)液中,重新培養(yǎng)。

此時,不應(yīng)使用PCR方法檢測細胞中支原體。由于支原體解體,故PCR結(jié)果為假性強陽性。

具體操作流程見下圖:

 

Mynox®祛除貼壁細胞中支原體的流程圖

Mynox®殺除支原體功能強大有效,但由于價格昂貴,上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右,使得應(yīng)用于細胞保種的數(shù)量受到價格的限制。

方法三:對于已耗費很多時間,大量擴增起來的細胞,或經(jīng)過基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過的細胞,如果發(fā)現(xiàn)細胞被支原體污染了,怎么辦?此時由于前期工作量巨大,使操作人員無法丟棄已有細胞。

但由于價格原因,又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體,

同時,實驗人員還需要清除細胞上的支原體污染,讓實驗得以往下推進,以終獲得準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)。

此時,實驗者可選用對支原體*的抑制劑,通過對細胞的前期處理,中期加藥,逐步通過4代左右的培養(yǎng),得以將支原體污染*清除,確保試驗順利推進,結(jié)果準(zhǔn)確。

*此類試劑眾多,筆者周圍的實驗人做過很多嘗試,其中效果確切且性價比較高的當(dāng)屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是:通過抑制支原體增殖中某種蛋白的合成,達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復(fù)合型的新型抗生素。

注:使用ZellShield®時,不需使用鏈青霉素。

 

操作步驟:

一步:研究發(fā)現(xiàn),98%的支原體污染發(fā)生在細胞間隙。因此,首先要把細胞消化下來,放入離心管,懸浮沖洗,離心,棄上清,反復(fù)三次。此時可將細胞上大部分的支原體去除,為進一步加藥抑制做好準(zhǔn)備。

第二步:培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield®,細胞進行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制,舊的支原體隨著細胞的換液逐步減少,通過4代左右的培養(yǎng),細胞中的支原體基本可被*清除。

此試劑價格約2800元/50ml,1%濃度使用,可保證大量細胞的實驗得以順利推進。性價比較高,但祛除過程時間稍長。

有些細胞保種中心,當(dāng)珍貴細胞被支原體污染后,會將Mynox®和ZellShield®結(jié)合使用,效果確切,結(jié)果令人滿意。

工作環(huán)境中支原體污染,解決方案

如果實驗室的細胞經(jīng)常發(fā)生支原體污染,則需考慮的污染源可能來以下幾個方面:

1、細胞種子被污染,解決方法參見以上“方法二”和“方法三”;

2、細胞培養(yǎng)中,使用未經(jīng)嚴(yán)格過濾祛除支原體的牛血清。

某些血清生產(chǎn)廠,為低價占領(lǐng)市場同時還能獲得充足利潤,他們需要降低生產(chǎn)成本,所以會將生產(chǎn)中,成本高的100nm過濾三次的步驟縮減,導(dǎo)致血清成為支原體的污染源。

(標(biāo)準(zhǔn)的血清生產(chǎn)規(guī)范為:粗血清需經(jīng)七次過濾,后三次為100nm加壓過濾,可以清除支原體);

此情況需詳細考察血清供貨商的專業(yè)程度,通過索要《檢測報告》等書面文件為血清獲得更多質(zhì)量保證。同時,對專業(yè)水平不高的血清供貨商,適當(dāng)延長血清試用期。

3、潔凈臺、細胞培養(yǎng)箱內(nèi)部、培養(yǎng)箱水槽、液氮罐,培養(yǎng)間內(nèi)部的水浴鍋等環(huán)境被支原體污染,可對工作區(qū)域進行消毒。有以下三種方法:

A、甲醛高錳酸鉀熏蒸消毒

  •  
  • 40%甲醛溶液用量為10ml/m3,高錳酸鉀用量為5g/m3
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  • 先將稱好的高錳酸鉀放到開放性容器內(nèi),然后倒入甲醛溶液
  •  
  • 人員迅速撤離,密閉消毒空間
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  • 熏蒸消毒要求密閉消毒24h以上

缺點:甲醛有刺激氣味,細胞間1-2周無法使用。

B、酒精擦拭

  •  
  • 用75%的酒精對超凈臺、培養(yǎng)箱、桌面等進行擦拭
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  • 再通風(fēng)10分鐘
  •  
  • 紫外照射30分鐘

缺點:操作較為繁瑣,酒精容易揮發(fā),消毒維持時間不長。

C、用專門清除支原體的噴霧劑或濕巾消毒

目前,被各大實驗室普遍使用的是Mycoplasma-offTM噴霧劑和濕紙巾。它添加了可主動殺除支原體的Mynox®試劑,可在 幾分鐘內(nèi)將支原體確切殺除,無殘留,無腐蝕性,無致癌性。

  •  
  • 均勻噴于待消毒的潔凈臺或?qū)嶒炘O(shè)備表面
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  • 等待5-10分鐘
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  • 用干燥紙巾將噴過的表面擦拭干凈
  •  
  • 通風(fēng)2-3分鐘

對于移液器,門把手,電話等器材,可使用支原體清除濕巾。擦拭后,應(yīng)讓其被消毒物體的表面保持濕潤,再讓其自然風(fēng)干。

D、培養(yǎng)箱水槽、培養(yǎng)間內(nèi)部的水浴鍋

水槽經(jīng)常會成為支原體以及真菌霉菌滋生的污染源。

解決方法:

  •  
  • 勤于清洗顯得尤為重要。
  •  
  • 上普遍使用一種水源保護劑0.5%WaterShieldTM,加入水中,預(yù)防水源被支原體、真菌、霉菌污染。此試劑不易揮發(fā)。一個月有效。

水槽只需定期添水即可。

優(yōu)點:操作方便,價格便宜。

總之,細胞培養(yǎng)中,支原體污染發(fā)生頻繁。有時帶來的危害會造成實驗的巨大損失。應(yīng)經(jīng)常檢測和及時排除支原體污染,讓細胞在健康安全的環(huán)境下生長,為獲得準(zhǔn)確的實驗結(jié)果,打下良好的基礎(chǔ)。

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