支原體有多種檢查方法，其中熒光法檢測支原體DNA是藥典記載的方法，又被稱為DNA染色法或指示細(xì)胞培養(yǎng)法。它的原理和操作大致如下：

將供試品接種于指示細(xì)胞（無污染的Vero 細(xì)胞或經(jīng)國家藥品檢定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的其他細(xì)胞，供試品應(yīng)對該細(xì)胞生長無影響。下面以Vero細(xì)胞為例）中培養(yǎng)后，用特異熒光染料（如Hoechst 33258）染色。

Vero 細(xì)胞經(jīng)消化后，需制成每1ml含10的5次方的細(xì)胞懸液，以每孔0. 5ml接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。每孔再加無抗生素DMEM培養(yǎng)基3ml，在細(xì)胞孵箱培養(yǎng)過夜，備用。

無抗生素培養(yǎng)基中加入供試品后，細(xì)胞需至少傳一代，然后取細(xì)胞已長滿且3 天未換液的細(xì)胞培養(yǎng)上清液待檢。

在制備好的指示細(xì)胞培養(yǎng)板中加入2ml待檢細(xì)胞培養(yǎng)上清，36°C培養(yǎng)3-5 天。指示細(xì)胞培養(yǎng)物至少傳代1 次，末次傳代培養(yǎng)用含蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)3-5 天后，吸出培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，加入固定液5ml，放置5分鐘，吸出固定液，再加5ml 固定液固定10分鐘。再次吸出固定液，使蓋玻片在空氣中干燥，加

DNA 染料工作液5ml，加蓋，室溫放置30分鐘，洗3 次，干燥，封片。用熒光顯微鏡觀察。

陰性對照僅見指示細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色熒光。陽性對照熒光顯微鏡下除細(xì)胞外，可見大小不等、不規(guī)則的熒光著色顆粒。有污染的供試品表現(xiàn)應(yīng)與陽性對照相同。

支原體DNA染色法的優(yōu)勢是：

1.適用于一些不易培養(yǎng)的支原體，如豬鼻支原體，分離培養(yǎng)法對該支原體檢測并不可靠，但可用DNA染色法準(zhǔn)確地檢測出來。

2. 操作簡單

3. 靈敏度尚可。

支原體DNA染色法的不足是：

1. 需4-14天后才出結(jié)果，時間較長。

2. 存在有假陽性和假陰性。如一些死亡細(xì)胞釋放出來的DNA會造成很大干擾，使得判斷誤差發(fā)生率大約在30%左右，因此使用這個方法需要一定的經(jīng)驗(yàn)。

因此，目前有一種趨勢是進(jìn)行支原體常規(guī)PCR和支原體qPCR的檢測，只要支原體方法驗(yàn)證保證其靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，只要該方法與藥典方法相比具有可比性，即可代替培養(yǎng)法或DNA染色法。

方法驗(yàn)證可通過一些支原體標(biāo)準(zhǔn)品來進(jìn)行，同時需要注意的是，樣本都需經(jīng)過DNA抽提，否則其中可能含有抑制PCR反應(yīng)的物質(zhì)，導(dǎo)致靈敏度下降。

感謝北京締一生物提供相關(guān)信息。